在實驗室的精密世界里，數(shù)據(jù)就是生命。而高效液相色譜儀（HPLC）作為分析領(lǐng)域的“黃金標準”，其狀態(tài)的優(yōu)劣直接決定了實驗結(jié)果的可靠性。一臺未經(jīng)精準校準的HPLC，就像一把刻度模糊的尺子，測量結(jié)果自然令人難以信服。本文將為您系統(tǒng)梳理HPLC校準的核心范圍、主流方法及關(guān)鍵注意事項，助您牢牢守住數(shù)據(jù)質(zhì)量的生命線。

一、校準范圍：全面覆蓋，不留死角

HPLC的校準絕非簡單“調(diào)零”，而是一項系統(tǒng)工程，需覆蓋影響分析結(jié)果的各個關(guān)鍵環(huán)節(jié)：

輸液系統(tǒng)：這是HPLC的“心臟”。

流量精度與準確度：確保流速穩(wěn)定且與設(shè)定值一致。即使微小的偏差（如1%），在長時間運行或方法轉(zhuǎn)移時也會導(dǎo)致保留時間漂移和定量誤差。

梯度組成準確度：對于梯度洗脫方法，必須驗證不同比例下流動相組成的準確性，這對復(fù)雜分離至關(guān)重要。

檢測器系統(tǒng)：這是儀表的“眼睛”。

紫外/可見光（UV-Vis）檢測器：需校準波長準確度（確保在正確波長下檢測）和光度準確性（確保吸光度讀數(shù)準確）。

熒光檢測器（FLD）：校準激發(fā)和發(fā)射波長準確度，以及靈敏度。

示差折光檢測器（RID）：校準基線穩(wěn)定性和靈敏度。

二極管陣列檢測器（DAD）：除波長和光度準確性外，還需關(guān)注光譜分辨率。

柱溫箱：溫度的“恒溫器”。

溫度準確度與穩(wěn)定性：溫度直接影響保留時間、分離度和峰形。必須驗證設(shè)定溫度與實際溫度的一致性，及其在運行過程中的波動范圍。

自動進樣器：精確的“采樣手”。

進樣體積精度與準確度：尤其對小體積進樣（如10μL以下），微小的誤差會直接放大為顯著的定量錯誤。

攜帶污染：評估高濃度樣品對后續(xù)低濃度樣品分析的影響。

表1.HPLC校準核心范圍及關(guān)鍵指標

二、校準方法：遵循權(quán)威，步步為營

規(guī)范的校準必須依據(jù)公認的標準，通常采用以下方法：

依據(jù)標準規(guī)程：嚴格遵循 《JJG 705-2014 液相色譜儀》國家計量檢定規(guī)程 或權(quán)威藥典（如USP、EP、ChP）中的相關(guān)章節(jié)。這些標準詳細規(guī)定了校準項目、使用標準物質(zhì)、環(huán)境條件、具體步驟和可接受標準。

使用有證標準物質(zhì)（CRM）：校準的核心。例如：

流量校準：使用經(jīng)過計量的微量量筒和秒表，或更精密的電子流量計。

紫外檢測器波長校準：使用氧化鈥濾光片或特定波長溶液（如苯甲醇的甲醇溶液）。

光度準確性校準：使用重鉻酸鉀的硫酸溶液等標準物質(zhì)。

梯度準確性校準：采用紫外示差法或電導(dǎo)法進行測定。

執(zhí)行系統(tǒng)適用性試驗（SST）：在分析方法框架下，使用特定測試混合物（常含尿嘧啶、硝基苯、苯甲醚等）評估系統(tǒng)的整體性能，包括理論塔板數(shù)、拖尾因子、分離度和重復(fù)性。這是將儀器校準與實際應(yīng)用連接的橋梁。

表2.HPLC校準方法及依據(jù)標準

三、關(guān)鍵注意事項：細節(jié)決定成敗

3.1建立動態(tài)、分層的校準周期體系（核心擴充內(nèi)容）

校準絕非“一勞永逸”或“一成不變”。建立一個科學(xué)、分層的周期體系，是平衡運行成本與數(shù)據(jù)風(fēng)險的關(guān)鍵。

1. 法定周期性檢定（長周期基礎(chǔ)校準）：

周期： 通常為一年。這是指由法定計量機構(gòu)或取得資質(zhì)的內(nèi)部計量部門，依據(jù)國家檢定規(guī)程（JJG）進行的全面、強制性檢定，并出具具有法律效力的檢定證書。這是儀器合規(guī)性的“基石”。

2. 內(nèi)部性能核查/校準（中周期核心校準）：

周期： 建議每3至6個月，或根據(jù)使用頻率和關(guān)鍵程度進行調(diào)整。

內(nèi)容： 由實驗室內(nèi)部資深人員，使用有證標準物質(zhì)（CRM），對流量、檢測器波長與光度準確性、梯度準確性、柱溫箱溫度、自動進樣器精度等核心參數(shù)進行系統(tǒng)性測試與調(diào)整。此周期校準是確保儀器長期性能飄移受控的核心環(huán)節(jié)。

3. 方法相關(guān)的系統(tǒng)適用性測試（短周期/每批次驗證）：

周期： 每次開機后、每個分析批次開始前，或連續(xù)運行中每隔一定時間（如24小時）。

內(nèi)容： 執(zhí)行特定分析方法的“系統(tǒng)適用性試驗（SST）”，使用該方法的測試混合標樣，驗證理論塔板數(shù)、拖尾因子、分離度、重復(fù)性（RSD） 等指標是否達標。這是將儀器狀態(tài)與當前分析任務(wù)直接掛鉤的“實時健康檢查”，確保即時數(shù)據(jù)的有效性。

4. 觸發(fā)式校準（非周期，事件驅(qū)動）：

遇到以下情況，必須在問題解決后立即執(zhí)行相關(guān)校準，無論上次校準在何時：

儀器移動或搬遷后。

關(guān)鍵硬件更換或維修后（如泵頭、密封圈、檢測器燈、流通池、自動進樣器注射器等）。

分析結(jié)果出現(xiàn)無法解釋的異常趨勢或偏差時（如保留時間系統(tǒng)性漂移、峰面積重復(fù)性變差、基線異常）。

執(zhí)行新的、極其關(guān)鍵的或?qū)纫髽O高的分析項目前。

經(jīng)過長時間停機后重新啟用。

制定策略的建議： 實驗室應(yīng)基于儀器的使用頻率、分析任務(wù)的關(guān)鍵性（如研發(fā)、質(zhì)檢、放行）、所遵循的質(zhì)量體系要求（GMP/GLP, ISO 17025）以及歷史性能數(shù)據(jù)，書面化規(guī)定每臺HPLC的校準周期策略，并嚴格執(zhí)行和記錄。

3.2 校準前充分準備

（此部分與之前內(nèi)容保持一致，略作銜接）在執(zhí)行任何層級的校準前，都必須確保儀器狀態(tài)穩(wěn)定。進行必要的維護（如更換密封圈、清洗泵頭、沖洗流通池），并在規(guī)定的環(huán)境條件下穩(wěn)定數(shù)小時。務(wù)必使用HPLC級溶劑和新鮮配制的流動相與標準溶液。

3.3 完整記錄，形成溯源鏈

（此部分與之前內(nèi)容保持一致）詳細記錄每次校準（包括周期性檢定、內(nèi)部校準、SST）的日期、標準物質(zhì)信息、環(huán)境條件、原始數(shù)據(jù)、計算結(jié)果、執(zhí)行人員及結(jié)論。所有記錄應(yīng)可追溯，這是質(zhì)量體系的剛性要求。

3.4 理解“校準”與“核查/驗證”的層級關(guān)系

（此部分整合優(yōu)化）應(yīng)明確區(qū)分：

校準： 通過操作建立測量儀器輸出值與標準值之間的關(guān)系，可能涉及調(diào)整（如調(diào)整波長、補償流量）。

檢定： 法定的全面校準，結(jié)論為“合格”或“不合格”。

核查/驗證（如SST）： 在不做調(diào)整的情況下，確認儀器性能是否滿足特定預(yù)期用途的要求。

它們共同構(gòu)成了一個從“法定符合”到“全面性能”再到“即時可用”的完整質(zhì)量保障金字塔。

表3.HPLC分層校準周期及觸發(fā)條件

常見問題答疑（FAQ）：破解校準實戰(zhàn)疑惑

在實際操作中，用戶常會遇到一些典型困惑。以下精選三個高頻問題，為您提供清晰解答：

Q1：我們的HPLC每年都送外檢定且合格，為什么日常分析中，數(shù)據(jù)的重復(fù)性有時還是會出現(xiàn)問題？

A1： 年度檢定合格，僅代表儀器在送檢時的那一時刻，其核心計量參數(shù)符合國家規(guī)程的寬泛要求。它無法保證儀器在長期、高頻次、特定分析方法下的持續(xù)穩(wěn)定。數(shù)據(jù)重復(fù)性問題，更多與以下因素相關(guān)：

日常性能漂移： 泵密封圈磨損導(dǎo)致的微小流量波動、檢測器燈能量衰減、色譜柱效能下降等，都會在檢定周期內(nèi)發(fā)生。

解決方法： 這正是加強內(nèi)部季度校準和嚴格執(zhí)行每批次系統(tǒng)適用性試驗（SST） 的意義所在。SST能直接暴露當前方法下儀器狀態(tài)的微小變化，是確保日常數(shù)據(jù)可靠的第一道防線。

Q2：校準過程中，如果某個參數(shù)（如自動進樣器精度）略微超出標準，但勉強能用，可以忽略嗎？

A2：絕對不可以。 “勉強能用”是分析實驗室的大忌。校準標準是保證數(shù)據(jù)準確性的底線。

風(fēng)險： 一個參數(shù)的微小偏差，可能會被后續(xù)的分析步驟放大。例如，自動進樣器1%的體積誤差，可能導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)系統(tǒng)性偏差，在痕量分析或含量均勻度檢查中會造成誤判。

正確處理流程：

立即停止使用該儀器進行正式樣品分析。

排查原因： 檢查進樣針是否堵塞、彎曲，密封圈是否泄漏，沖洗程序是否充分。

維修與再校準： 進行必要的維護或部件更換后，必須重新對該參數(shù)進行校準，直至其完全符合標準，并記錄整個偏差處理過程。

Q3：對于主要用于教學(xué)或初步篩選的非關(guān)鍵項目，HPLC的校準可以簡化或延長周期嗎？

A3： 校準的嚴格程度應(yīng)與 “測量結(jié)果的風(fēng)險影響” 相匹配。但“簡化”不等于“取消”。

基本原則： 即使對于非GMP/GLP的研究或教學(xué)用途，也應(yīng)保證數(shù)據(jù)的基本可信度與教學(xué)演示的正確性。

建議方案：

周期可以適當延長， 例如內(nèi)部性能校準可調(diào)整為6-12個月，但仍需進行年度檢定以確保儀器基礎(chǔ)功能正常。

校準項目可以聚焦核心： 可重點關(guān)注流量準確性、檢測器波長等影響基本定性與相對定量的參數(shù)。

日常驗證不可?。?每次使用前，必須進行基本的系統(tǒng)適用性測試（如進樣標準品檢查保留時間和峰面積的重復(fù)性）。這既能保證當次數(shù)據(jù)可用，也是培養(yǎng)學(xué)生良好科研習(xí)慣的關(guān)鍵。

高效液相色譜儀的校準，是一項融合了技術(shù)、標準與動態(tài)管理思維的嚴謹工作。通過建立并嚴格執(zhí)行一套 “法定周期為基礎(chǔ)、內(nèi)部校準為核心、系統(tǒng)適用性為日常、事件觸發(fā)為保障” 的立體化、分層校準周期體系，并厘清常見操作誤區(qū)，您不僅能滿足合規(guī)性要求，更能主動駕馭儀器性能，將數(shù)據(jù)風(fēng)險降至低。投資于這樣一套科學(xué)的校準策略，就是為實驗室的每一份報告、每一項發(fā)現(xiàn)，鑄就堅實的可信度基石。