在藥品研發(fā)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)和化工分析等領(lǐng)域，高效液相色譜儀（HPLC） 是進(jìn)行精準(zhǔn)定量分析的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”工具。無論是檢測(cè)藥品的有效成分，還是分析食品中的添加劑含量，其終的含量測(cè)定結(jié)果都至關(guān)重要。本文將深入淺出地解析HPLC含量測(cè)定的核心原理、關(guān)鍵計(jì)算公式，并解答三個(gè)令實(shí)驗(yàn)人員頭疼的實(shí)戰(zhàn)問題，助您夯實(shí)基礎(chǔ)，提升分析效率與準(zhǔn)確性。

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一、核心原理：分離與比較的藝術(shù)

HPLC含量測(cè)定本質(zhì)上是一個(gè) “先分離，后比較” 的過程。

高效分離：待測(cè)樣品經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入色譜柱。由于各組分在流動(dòng)相（液體）和固定相（柱內(nèi)填料）間的分配能力不同，在高壓泵送的流動(dòng)相帶動(dòng)下，各組分以不同速度遷移，從而實(shí)現(xiàn)高精度分離。

精準(zhǔn)檢測(cè)：流出色譜柱的組分進(jìn)入檢測(cè)器（如紫外檢測(cè)器），其濃度信號(hào)被轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，形成一個(gè)個(gè)色譜峰。

定量依據(jù)：這是定量的基石——在一定濃度范圍內(nèi)，組分的峰面積（A）或峰高（h）與其濃度（c）成正比。通過與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（對(duì)照品）進(jìn)行比較，即可計(jì)算出未知樣品的含量。

二、兩大經(jīng)典方法及計(jì)算公式詳解

1. 外標(biāo)法——直接的對(duì)比法

原理：直接用樣品中待測(cè)組分的信號(hào)與對(duì)照品的信號(hào)進(jìn)行比較。

單點(diǎn)校正公式（適用于濃度接近時(shí)）：

含量（%）= (A樣 / A對(duì)) × (c對(duì) / c樣) × 100%

（A：峰面積；c：溶液濃度）

標(biāo)準(zhǔn)曲線法（更通用、更準(zhǔn)確）：

首先用一系列不同濃度的對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（線性方程：y = ax + b，y為峰面積，x為濃度）。將樣品的峰面積代入，求得其溶液濃度c樣測(cè)，再通過下式計(jì)算：

含量（%）= (c樣測(cè) × V × D / W) × 100%

（V：樣品定容體積；D：稀釋倍數(shù)；W：樣品稱樣量）

2. 內(nèi)標(biāo)法——抵消誤差的精密法

原理：在樣品和對(duì)照品中加入已知量、性質(zhì)接近的內(nèi)標(biāo)物，通過比較待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值來定量。此法可有效抵消進(jìn)樣誤差和前處理?yè)p失。

核心公式：

先由對(duì)照品求校正因子 F = (A內(nèi)標(biāo)對(duì) / A對(duì)) × (c對(duì) / c內(nèi)標(biāo))

再計(jì)算樣品含量 含量（%）= F × (A樣 / A內(nèi)標(biāo)樣) × (c內(nèi)標(biāo) / c樣) × 100%

掌握HPLC含量測(cè)定的原理與計(jì)算，并深刻理解實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵細(xì)節(jié)和常見問題，是獲得可靠數(shù)據(jù)的前提。無論您是分析新手還是經(jīng)驗(yàn)豐富的工程師，從精準(zhǔn)的樣品前處理、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)曲線建立，到對(duì)儀器狀態(tài)的敏銳洞察，每一步都決定著分析的成功與否。希望本文能成為您HPLC定量分析工作中的實(shí)用指南，助您攻克難關(guān)，讓每一次檢測(cè)都精準(zhǔn)無誤。

表1.HPLC含量測(cè)定兩大經(jīng)典定量方法對(duì)比

表2.HPLC含量測(cè)定核心計(jì)算公式匯總

表3.HPLC含量測(cè)定關(guān)鍵操作質(zhì)量控制點(diǎn)

實(shí)戰(zhàn)中必知的3個(gè)常見問題（Q&A）

Q1：標(biāo)準(zhǔn)曲線在高濃度點(diǎn)不呈線性了，怎么辦？

A：這通常是檢測(cè)器響應(yīng)飽和或色譜柱過載的信號(hào)。解決方案：首先將樣品溶液適當(dāng)稀釋，使其落入線性范圍。同時(shí)，重新評(píng)估并建立覆蓋實(shí)際樣品濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。確保儀器狀態(tài)良好，必要時(shí)可驗(yàn)證非線性擬合的適用性。

Q2：峰面積重現(xiàn)性差（RSD超標(biāo)），如何系統(tǒng)排查？

A：這是多因素問題，建議按以下順序排查：

首要檢查進(jìn)樣系統(tǒng)：自動(dòng)進(jìn)樣器針頭是否堵塞或有氣泡？手動(dòng)進(jìn)樣操作是否規(guī)范？

檢查樣品溶液：是否穩(wěn)定？是否完全溶解、過濾？現(xiàn)配現(xiàn)用。

確認(rèn)色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性：泵流速是否穩(wěn)定？檢測(cè)器（尤其是紫外燈）能量是否充足？柱溫是否恒定？

復(fù)核積分參數(shù)：確保色譜數(shù)據(jù)處理軟件中的積分方法設(shè)置一致、合理。

Q3：外標(biāo)法中，樣品前處理的“定容”體積不準(zhǔn)，影響大嗎？

A：影響巨大且是直接影響。從公式 含量（%）= (c樣測(cè) × V × D / W) × 100% 可見，定容體積（V）與計(jì)算結(jié)果成正比。例如，100mL定成99mL，結(jié)果就會(huì)產(chǎn)生約1%的正偏差。關(guān)鍵操作：務(wù)必使用經(jīng)過校準(zhǔn)的A級(jí)容量瓶，并嚴(yán)格按照“液面凹緣與刻度線相切”的要求進(jìn)行定容，這是保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確的生命線。

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