高效液相色譜（HPLC）是實驗室的“眼睛”，但流速不準(zhǔn)會導(dǎo)致保留時間漂移、峰形變差、結(jié)果不可靠。本文將深入解析流速不準(zhǔn)的六大原因，并提供完整的排查與解決方案，助您快速恢復(fù)儀器狀態(tài)，確保數(shù)據(jù)精準(zhǔn)。

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一、癥狀識別：您的HPLC流速真的不準(zhǔn)嗎？

在深入原因前，請先確認(rèn)是否出現(xiàn)以下癥狀：

保留時間不穩(wěn)定：同一方法，連續(xù)進樣保留時間持續(xù)提前或延后。

系統(tǒng)壓力異常：壓力過高、過低或劇烈波動（排除色譜柱和流動相因素后）。

峰形變差：出現(xiàn)前沿峰、拖尾峰或分叉峰。

定量結(jié)果重復(fù)性差：平行樣品的峰面積或高度差異顯著。

二、六大核心原因深度解析與解決方案

1. 泵系統(tǒng)問題（常見根源）

單向閥故障：閥球污染、磨損或卡住，導(dǎo)致溶劑輸送不連續(xù)。

解決方案：拆下單向閥，置于異丙醇中超聲清洗20分鐘；嚴(yán)重磨損需更換。

密封墊泄漏或磨損：泵頭密封圈老化，導(dǎo)致內(nèi)部或外部泄漏。

解決方案：定期更換密封墊（通常每3-6個月或按泵沖數(shù)計），更換時用異丙醇清潔柱塞桿。

柱塞桿磨損或劃傷：影響泵的容積精度。

解決方案：檢查柱塞桿表面，輕微磨損可拋光處理，嚴(yán)重則需更換。

比例閥故障（針對四元泵）：影響梯度洗脫的準(zhǔn)確性。

解決方案：執(zhí)行儀器自帶的比例閥測試和清洗程序。

2. 流動相與脫氣問題

溶解氣體未脫盡：流動相中的氣泡在泵或檢測器中形成空穴，導(dǎo)致流速不穩(wěn)、壓力波動和基線噪音。

解決方案：充分脫氣！使用在線脫氣機，或采用氦氣脫氣、超聲脫氣至少15分鐘。確保儲液瓶濾頭浸沒，管路無泄漏入口。

流動相粘度變化：特別是使用不同比例混合溶劑時，環(huán)境溫度變化會導(dǎo)致粘度變化，影響流速穩(wěn)定性。

解決方案：使用柱溫箱穩(wěn)定溫度，對于敏感方法，考慮使用預(yù)混合流動相。

3. 管路與連接問題

管路堵塞：特別是進口濾頭、在線過濾器、保護柱或色譜柱入口篩板堵塞。

解決方案：分段排查。從泵出口開始，逐段斷開，觀察壓力變化。超聲清洗濾頭、篩板或更換過濾器。

微泄漏（尤其危險）：接頭松動、管路切割不平整導(dǎo)致肉眼難以發(fā)現(xiàn)的微小泄漏。

解決方案：用無塵布檢查各接頭是否有濕潤跡象。使用專用工具重新切割并緊固管路。

4. 儀器設(shè)置與校準(zhǔn)問題

校準(zhǔn)數(shù)據(jù)過期：長期未進行流速校準(zhǔn)，儀器實際輸出與設(shè)定值產(chǎn)生偏差。

解決方案：定期執(zhí)行流速校準(zhǔn)。使用稱重法（收集流動相1分鐘，精密天平稱重）或流量計驗證實際流速，并在儀器軟件中錄入修正因子。

5. 軟件與控制故障

控制參數(shù)錯誤：方法文件中流速單位設(shè)置錯誤（如將mL/min誤設(shè)為μL/min）。

解決方案：仔細(xì)檢查方法參數(shù)，進行“傻瓜式”復(fù)查。

電子控制單元故障：泵驅(qū)動馬達或控制電路板故障（相對少見但嚴(yán)重）。

解決方案：聯(lián)系儀器廠家工程師進行專業(yè)診斷與維修。

6. 環(huán)境因素

實驗室溫度波動大：影響溶劑粘度和泵的機械性能。

解決方案：將HPLC放置在溫度穩(wěn)定的環(huán)境中，避免空調(diào)直吹或陽光照射。

三、高效排查流程圖：一步步鎖定元兇

第1步：壓力觀察 → 壓力異常？是 → 檢查堵塞/泄漏/脫氣。

→ 壓力穩(wěn)定但流速不準(zhǔn)？進入第2步。

第2步：簡單測試 → 用稱重法測試實際流速。

→ 實測與設(shè)定值一致？是 → 問題可能在檢測器或色譜柱。

→ 不一致？進入第3步。

第3步：泵系統(tǒng)排查 → 執(zhí)行泵沖洗和密封墊清洗程序，檢查單向閥。

第4步：校準(zhǔn)與維護 → 進行流速校準(zhǔn)，檢查并更新儀器維護記錄。

表1.HPLC流速異常排查速查表

四、預(yù)防性維護計劃：防患于未然

每日：檢查壓力穩(wěn)定性，觀察有無泄漏，確保流動相足量且脫氣充分。

每周：用純水或甲醇高流速沖洗系統(tǒng)，清洗進樣針和樣品瓶。

每月：清洗或超聲清洗單向閥、在線過濾器，檢查密封墊狀態(tài)。

每季度：執(zhí)行全面的流速、梯度和壓力準(zhǔn)確性校準(zhǔn)。

每半年或按需：更換泵密封墊、柱塞桿等易損件。

表2.HPLC核心部件維護周期及要點表

HPLC流速不準(zhǔn)并非單一問題，而是系統(tǒng)狀態(tài)的“警報”。通過系統(tǒng)性的排查——從簡單的流動相脫氣、管路連接到精密的泵系統(tǒng)維護與定期校準(zhǔn)——您可以快速定位并解決問題，確保儀器始終處于佳工作狀態(tài)。

牢記：預(yù)防勝于治療。 建立并嚴(yán)格執(zhí)行定期維護計劃，是保證實驗數(shù)據(jù)長期可靠、延長儀器壽命、降低總擁有成本（TCO）的高效投資。

常見問題（FAQ）：

問題一：為什么我的液相色譜壓力顯示正常，但保留時間卻一直在往后漂移？這算流速不準(zhǔn)嗎？

答： 這很可能是 “隱性”流速不準(zhǔn) 的典型表現(xiàn)。雖然系統(tǒng)壓力穩(wěn)定，但實際流速可能已低于設(shè)定值。

核心原因：常見的是 泵密封墊發(fā)生輕微內(nèi)漏。溶劑從高壓端通過磨損的密封墊少量漏回低壓端，泵的實際輸出效率下降。由于泄漏量穩(wěn)定，系統(tǒng)壓力可能看起來正常，但單位時間內(nèi)送到色譜柱的流動相體積減少了，導(dǎo)致保留時間不斷延后。

解決辦法：

首要檢查：觀察泵頭是否有滲液。執(zhí)行泵的“密封墊清洗”程序（用含一定比例水的溶劑，例如水:異丙醇=80:20，高流速沖洗）。

驗證：使用稱重法精確測量1分鐘內(nèi)泵出的流動相重量，換算成體積，與設(shè)定流速對比。

終措施：如果確認(rèn)流速偏低且密封墊清洗無效，更換新的泵密封墊。

問題二：我剛換了新柱子，壓力變得特別高，流速也好像上不去，是柱子堵了嗎？

答： 新色譜柱本身堵塞的可能性較低。壓力超高伴隨流速問題，更應(yīng)優(yōu)先排查 “柱外因素”。

核心原因：換柱過程中，可能導(dǎo)致了 管路微堵塞或連接不當(dāng)。

管路堵塞：柱子入口管路或接頭處的 篩板/濾頭 可能因之前使用殘留的樣品或緩沖鹽沉淀而堵塞，換柱后在新柱的高背壓下問題凸顯。

接頭不當(dāng)：使用了不匹配的接頭或擰得過緊，導(dǎo)致管路端口變形、產(chǎn)生死體積或碎屑，形成局部堵塞。

解決辦法：

隔離判斷：斷開色譜柱，直接將兩通連接泵與檢測器，用正常流速測試。若壓力正常，則問題在柱子或柱連接處；若壓力仍高，則問題在柱前系統(tǒng)（管路、過濾器等）。

分段排查：從泵開始，逐段斷開并檢查壓力和流速，定位堵塞點。

清洗/更換：超聲清洗堵塞的濾頭、篩板或更換該段管路。

問題三：我做梯度洗脫時，基線噪音大，而且保留時間重復(fù)性很差，這和流速有關(guān)嗎？

答： 高度相關(guān)，這通常是 梯度洗脫過程中流速不穩(wěn)定 的綜合癥狀。

核心原因：

脫氣不充分（主要）：梯度混合時，不同溶劑的混合可能促使溶解氣體析出形成微小氣泡。氣泡在泵、混合器或檢測器中造成壓力脈動和流速波動，導(dǎo)致基線噪音和保留時間飄忽不定。

比例閥故障（對于低壓四元泵）：控制不同溶劑通道開關(guān)的比例閥若出現(xiàn)堵塞或動作遲緩，會導(dǎo)致混合比例不準(zhǔn)確，實際梯度與設(shè)定不符，本質(zhì)也是流動相輸送的“流速”不準(zhǔn)。

解決辦法：

徹底脫氣：確保所有通道的溶劑都經(jīng)過充分脫氣（使用在線脫氣機，或超聲/氦氣脫氣）。

檢查泄漏：確保所有溶劑瓶的輸液管濾頭完全浸沒，各通道無氣體吸入點。

執(zhí)行儀器維護：運行儀器的 “比例閥清洗” 程序，用高比例水相（如90%水）和異丙醇分別沖洗所有溶劑通道。

測試梯度準(zhǔn)確性：可以通過不接色譜柱，用純水代替，運行梯度程序并在檢測器（示差或UV在低波長下）觀察基線臺階變化，來初步判斷混合是否平滑、準(zhǔn)確。